Đề Xuất 3/2023 # Máy Pcr Là Gì? Công Dụng Của Máy Pcr Pockit Cầm Tay # Top 6 Like

Cập nhật nội dung chi tiết về Máy Pcr Là Gì? Công Dụng Của Máy Pcr Pockit Cầm Tay mới nhất trên website Cuocthitainang2010.com. Hy vọng thông tin trong bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu ngoài mong đợi của bạn, chúng tôi sẽ làm việc thường xuyên để cập nhật nội dung mới nhằm giúp bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất.

Những năm gần đây, với việc ứng dụng máy PCR trong chẩn đoán bệnh tôm đã giúp người nuôi sàng lọc và ngăn ngừa dịch bệnh lây lan từ đó giảm thiệt hại đáng kể, đem lại năng suất cao cho vụ nuôi. Nhưng nhiều người khi mới bước chân vào nghề vẫn còn băn khoăn chưa biết máy PCR là gì? Công dụng máy PCR ra sao? Nên mua máy PCR ở đâu uy tín hiện nay? Câu trả lời sẽ được chúng tôi giải đáp trong bài viết này.

Ngành nuôi tôm công nghiệp đang phát triển nhanh chóng, thu hút nhiều doanh nghiệp đầu tư và đem lại nguồn ngoại tệ lớn cho đất nước. Các mô hình nuôi tôm thâm canh mật độ cao ngày càng được mở rộng kéo theo đó là những thách thức về dịch bệnh, biến đổi khí hậu gây thiệt hại lớn cho vụ nuôi. Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm đã từng gây tổn thất lớn cho ngành tôm toàn cầu. Trong giai đoạn năm 2009 – 2016 dịch bệnh EMS/AHPND bùng phát mạnh mẽ đã gây thiệt hại khoảng 22,5 tỷ USD cho ngành nuôi tôm công nghiệp tại Châu Á. Với việc ứng dụng máy PCR trong xét nghiệm bệnh tôm là phương pháp hữu hiệu giúp chẩn đoán chính xác các loại bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn, virus gây ra, từ đó đưa ra biện pháp phòng trị hiệu quả nhất.

Tìm hiểu máy PCR là gì?

Máy PCR (máy luân nhiệt) là thiết bị không thể thiếu trong phòng Lab thủy sản, ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh do vi khuẩn, virus gây bệnh trên tôm và cá. Phản ứng PCR dựa vào đặc tính DNA bị biến tính ở nhiệt độ cao và hồi tính.

Kỹ thuật PCR được ứng dụng chẩn đoán bệnh tôm

Trước đây, PCR truyền thống cần phải có giai đoạn phân tích sau khi khuếch đại. Nhưng hiện nay, các loại máy PCR real time cho kết quả khuếch đại AND đích được hiển thị sau mỗi chu kỳ phản ứng PCR.

PCR real time là kỹ thuật nhân bản AND đích trong ống nghiệm thành nhiều bản sao dựa vào chu kỳ nhiệt khác nhau, kết quả khuếch đại sẽ được hiển thị cùng một lúc. Ưu điểm khi sử dụng máy PCR real time là không cần phải thực hiện thao tác điện di sản phẩm PCR trên gel agarose nhằm xác định sản phẩm sau khuếch đại.

Nguyên lý máy PCR hoạt động như nào?

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ sẽ lặp đi lặp lại 3 bước sau đây:

– Bước 1: Tách sợi DNA thành sợi đơn ở nhiệt độ 94 – 95 độ C

– Bước 2: Bắt cặp mồi vào sợi DNA nhiệt độ khoảng 55 – 65 độ C

– Bước 3: Kéo dài chuỗi mới ở nhiệt độ 72 độ C. Bước này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside triphosphate (dNTP).

Công dụng máy PCR trong nuôi tôm

Nắm được máy PCR là gì rồi thì chắc hẳn người nuôi còn băn khoăn không biết công dụng máy PCR trong nuôi tôm như thế nào đúng không?

Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực thủy sản, thú y, sinh dược, thực phẩm, nghiên cứu,… Trong nuôi tôm công nghiệp, máy PCR được sử dụng trong chẩn đoán, phát hiện nhanh các bệnh nguy hiểm trên tôm như: EMS, IMNV, YHV, EHP,….

Nếu trước đây, khi cần phải xét nghiệm bệnh tôm thì người nuôi cần phải tìm đến phòng thí nghiệm thủy sản. Nhưng giờ đây, khi khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, con người đã cho ra đời những loại máy PCR Pockit vận hành dựa trên công nghệ iiPCR cho phép chẩn đoán nhanh bệnh tôm ngay tại ao nuôi chỉ trong 1 giờ đồng hồ.

Máy PCR có thể chẩn đoán nhanh một số bệnh trên tôm như:

– WSSV: Bệnh đốm trắng trên tôm

– EHP: Bệnh vi bào tử trùng trên tôm

– AHPND/EMS: Bệnh hoại tự gan tụy trên tôm

– TSV: Hội chứng Taura trên tôm

– YHV: Bệnh đầu vàng trên tôm

– IMNV: Bệnh hoại tử cơ trên tôm

– IHHNV: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu

– NHPB: Vi khuẩn gây hoại tử trên tôm

– …..v.v.v

Xét nghiệm PCR phát hiện sớm Vibrio gây bệnh hoại tử gan tụy trên tôm

Ngoài ra, kỹ thuật PCR còn được ứng dụng để nhận dạng sinh vật, phát hiện các đột biến gen, nhân dòng gen, nghiên cứu sự biểu hiện den, tạp đột biến định vị,…

Ưu điểm của máy PCR

– Cho kết quả chính xác và nhanh chóng

– Đơn giản, dễ thực hiện

– Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cần cao

– Kỹ thuật PCR cho phép phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn, đột biến điểm

TOP 2 loại máy PCR nên dùng hiện nay

1. Máy PCR – Pockit Xpress

Pockit Xpress xuất xứ GeneReach Biotechnology – Đài Loan được vận hành dựa trên kỹ thuật IIPCR hiện đại với đầu dò Taqman cho phép chẩn đoán nhanh các bệnh thường gặp tên tôm thẻ chân trắng, tôm sú. Kết quả được hiển thị trên màn hình LCD, độ nhạy với 10 copy/ phản ứng. Sản phẩm đo được 8 mẫu/ lần đo và có thể tiến hành tại ao nuôi.

Máy Pockit Xpress có sẵn tại chúng tôi

2. Máy PCR – Pockit Micro Plus

Pockit Micro Plus cũng là một dòng máy xuất xứ GeneReach Biotechnology – Đài Loan nhưng thiết kế nhỏ gọn hơn so với máy Pockit Xpress. Máy được thiết kế màn hình cho phép đọc kết quả dương tính hoặc âm tính một cách chính xác. Độ nhạy 10 copy/ phản ứng, với 4 mẫu/ lần.

Máy Pockit Micro Plus xét nghiệm bệnh ngay tại ao nuôi Bà Lê Thị Sol Pha – Công ty CP Công nghệ AquaMekong cho biết: “Việc định kỳ sử dụng máy PCR để kiểm soát bệnh trong ao nuôi tôm là tiền đề lớn cho một vụ nuôi thành công. Chính vì thế, hãng GeneReach Biotechnology – Đài Loan đã đem đến công nghệ “Bác sĩ di động” giúp người nuôi chẩn đoán, phát hiện nhanh các bệnh trên tôm để có các biện pháp phòng và trị bệnh một cách hiệu quả. Việc sử dụng máy PCR trong nuôi tôm còn đem lại lợi ích đáng kể trong việc: kiểm tra chất lượng con giống, quản lý tốt sức khỏe tôm nuôi, đồng thời sàng lọc các mối rủi ro, ngăn ngừa sự lây lan dịch bệnh.”

Đại chỉ mua máy PCR uy tín

Đứng trước tình hình nuôi tôm công nghiệp tại Việt Nam gặp nhiều về cản trở như dịch bệnh, biến đổi hậu,… Một trong những giải pháp khắc phục hiệu quả là áp dụng công nghệ 4.0 vào thủy sản nhằm giúp người nuôi kiểm soát dịch bệnh hiệu quả nhất. Hiểu được điều đó, chúng tôi đã hợp tác với hãng GeneReach Biotechnology – Đài Loan đem đến cho người nuôi tôm 2 loại máy Pockit Xpress, Pockit Micro Plus với mức giá hợp lý.

Máy PCR giá bao nhiêu tại Dr.Tom?

Hiện tại chúng tôi bán máy PCR Pockit Xpress có mức giá 130.000.000 VNĐ; Máy PCR cầm tay Pockit Micro Plus có giá 54.800.000 VNĐ. Với mức giá trên, đối với những hộ nuôi khá giả, có hệ thống ao nuôi lớn thì nên đầu tư 1 thiết bị PCR Pockit chuyên dụng. Còn đối với những hộ nuôi khó khăn hơn thì nên mua theo hình thức hợp tác xã, khoảng 3 – 4 hộ chung 1 máy Pockit Xpress hoặc Pockit Micro Plus để tiết kiệm chi phí đầu tư mà vẫn đảm bảo kiểm tra, kiểm soát được tình hình dịch bệnh trong ao nuôi tôm cách hiệu quả.

THAO TÁC XÉT NGHIỆM BỆNH TÔM BẰNG PCR POCKIT XPRESS

Top 2 loại PCR Pockit đang có sẵn tại chúng tôi Liên hệ ngay số HOTLINE 1900 2620 để được tư vấn chi tiết về công dụng, cách sử dụng, báo giá máy PCR tốt nhất. Hy vọng rằng, bài viết về máy PCR là gì và công dụng máy PCR đã giúp người nuôi có thêm kiến thức để áp dụng vào kiểm soát dịch bệnh một cách hiệu quả nhất.

Pcr Là Gì? Nguyên Tắc, Qúa Trình &Amp; Ứng Dụng Của Máy Chu Kỳ Nhiệt

“PCR LÀ GÌ” Có lẽ khái niệm này thật sự khá xa lạ hoặc nếu đã từng gặp qua thì bạn cũng không biết được nó chính xác là gì? Thuật ngữ “PCR” này thực chất là chuỗi phản ứng polymerase nhưng quan trọng hơn nữa là làm thế nào để tạo nên PCR hay nguyên tắc hoạt động của chu kì PCR này như thế nào, một quá trình PCR được thực hiện thông qua bao nhiêu bước cũng như ứng dụng của nó quan trọng ra sao ?

Hôm nay Trung Sơn sẽ cùng với bạn khám phá những bí ẩn đằng sau cụm từ “PCR” và đặc biệt công ty sẽ hướng dẫn bạn cách làm cách nào để có thể tiến hành các bước trong chu kỳ PCR một cách nhanh và tiện lợi nhất có thể thông qua MÁY CHU KÌ NHIỆT.

PCR LÀ GÌ ?

Cụm từ PCR được viết tắt từ Polymerase Chain Reaction mang nghĩa là chuỗi phản ứng polymerase hay phản ứng khuếch đại gen.

DNA là gì? là phân tử mang thông tin di truyền dưới dạng bộ ba mã di truyền quy định mọi hoạt động sống (sinh trưởng, sinh sản, phát triển v.v) của các sinh vật và hầu hết virus. Đây là từ viết tắt thuật ngữ tiếng Anh deoxyribonucleic acid.

PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban đầu hoặc là một bản sao duy nhất.

Nó được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý DNA để giải trình tự. PCR giúp phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của một gen để xác định các tác nhân gây bệnh trong quá trình nhiễm trùng và khi tạo ra các cấu hình DNA pháp y từ các mẫu DNA nhỏ.

Phương pháp PCR này được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.

CÁC PHẦN CỐT LÕI TẠO NÊN PCR LÀ GÌ ?

Năm thành phần cốt lõi được yêu cầu để thiết lập một PCR gồm:

Mẫu DNA cần được sao chép.

Đoạn DNA ngắn bắt đầu phản ứng PCR, được thiết kế để liên kết với hai bên của phần DNA mà bạn muốn sao chép.

4 loại nucleotide DNA (còn được gọi là dNTPs) tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích. DNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1).

DNA polymerase chịu nhiệt enzyme : phải là men polymerase chịu được nhiệt độ. Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là men Taq polymerase. Đây là men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus.

Các loại muối cần thiết để tạo ra một môi trường thích hợp cho enzyme hoạt động. thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 2 1.5mM.

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt,nghĩa là các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA. Đoạn mồi (là đoạn DNA ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA mẫu và DNA polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR diễn ra, DNA mới được tạo ra từ DNA khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền khuếch đại theo cấp số nhân.

QUY TRÌNH CỦA PCR

Một quá trình pcr được thực hiện thông qua 3 bước chính là biến tính, ủ và mở rộng. Ba giai đoạn này được lặp lại 20-40 lần, gấp đôi số lượng bản sao DNA mỗi lần.

Giai đoạn biến tính

Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần cốt lõi khác được đun nóng đến 94-95⁰C.

Đối với những enzyme DNA polymerase bắt buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ

Nhiệt độ cao gây ra liên kết hydro giữa các bazơ trong hai dải DNA mẫu để phá vỡ và hai sợi tách rời. Điều này dẫn đến hai chuỗi DNA đơn lẻ, sẽ hoạt động như các khuôn mẫu để tạo ra các chuỗi DNA mới.

Điều quan trọng là nhiệt độ được duy trì ở giai đoạn này đủ lâu để đảm bảo rằng các sợi DNA đã tách hoàn toàn.

Điều này thường mất từ 15-30 giây.

Giai đoạn ủ

Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quá cao, mồi có thể không gắn được. Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng. Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA.

Các đoạn mồi được thiết kế để bổ sung theo thứ tự các đoạn ngắn của DNA trên mỗi đầu của chuỗi được sao chép.

Đoạn mồi được xem là tác nhân đầu tiên trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme polymerase chỉ có thể thêm các base DNA vào một chuỗi DNA kép. Chỉ một khi đoạn mồi được kế nối thì enzyme polymerase có thể gắn và bắt đầu tạo ra chuỗi DNA bổ sung mới từ các cơ sở DNA có liên kết rời rạc lúc đầu.

Hai dải DNA tách rời được bổ sung và chạy theo các hướng ngược.

Bước này thường mất khoảng 10-30 giây.

Giai đoạn mở rộng

Trong bước cuối cùng này, nhiệt được tăng lên 72⁰C để cho phép DNA mới được tạo ra bởi một enzyme enzyme Taq DNA polymerase đặc biệt bổ sung thêm các base DNA.

Các chuỗi ADN mới được tạo ra bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu. Một enzyme DNA polymerase kết hợp các nucleotide DNA tự do với nhau. Enzyme này thường là Taq polymerase, một enzyme ban đầu được phân lập từ một vi khuẩn ưa nhiệt gọi là Thermus aquaticus.

Thứ tự mà trong đó các nucleotide tự do được thêm vào được xác định bởi trình tự nucleotide trong sợi DNA gốc (mẫu).

Kết quả của một chu kỳ PCR là hai chuỗi chuỗi DNA mục tiêu, mỗi chuỗi chứa một sợi mới được tạo ra và một sợi ban đầu.

ỨNG DỤNG CỦA PCR

Chỉ cần nhìn vào ảnh thì bạn đã hình dung ra được phần nào các ứng dụng của phương pháp PCR này. Bây giờ chúng ta sẽ cùng đi chi tiết hơn từng ứng dụng để thấy được tầm quan trọng của phương pháp này.

Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để xác định các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật.

Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định một người bằng cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có. Về lý thuyết thì chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ.

Phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình lâu dài và khó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng phương pháp PCR. Mỗi gen trong câu hỏi có thể dễ dàng được khuếch đại qua PCR bằng cách sử dụng các loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để phát hiện đột biến.

Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR thông qua khuếch đại của DNA của virus. Phân tích này là có thể ngay sau khi nhiễm trùng, có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng thực tế xảy ra.

Nhân bản một gen không nên nhầm lẫn với nhân bản toàn bộ một sinh vật-mô tả quá trình cô lập một gen từ một sinh vật và sau đó chèn nó vào sinh vật khác. PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có thể được chèn vào một vector (vector là một phương tiện chèn một gen vào cơ thể) như một plasmid (một phân tử DNA vòng). Thể hiện một gen nhân bản cũng có thể là một cách để sản xuất hàng loạt hữu ích ví dụ protein-cho, thuốc men.

Sử dụng PCR nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm tuổi. Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn như một voi ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi.

MÁY CHU KÌ NHIỆT

Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy các thủy có nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt gồm các bộ phận chính như sau :

Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện.

Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đền buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện.

Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua dự điều khiển của bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Ðể làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ PCR.

Với bài viết này, Trung Sơn chúng tôi đã giúp bạn hình dung được PCR là gì cũng như những phần cốt lõi để tạo nên PCR và các gia đoạn chu trình để có thể tiến hành với PCR. Ngoài ra chúng tôi còn đề cập đến cho bạn những ứng dụng vượt trội của nó đối với cuộc sống con người cũng như đưa ra cho bạn một giải pháp để tiến hành PCR thuận lợi hơn. Công ty mong muốn bạn có thể tìm được một vài thông tin bổ ích cho mình và phục vụ nhu cầu của bạn. Hiện tại, Công Ty chúng tôi đang là đại lý phân phối chính hãng máy chu kỳ nhiệt và các thiết bị phòng thí nghiệm mà bạn quan tâm. Chúng tôi luôn nổ lực hết mình để đưa đến bạn những thông tin hữu ích nhất và hơn hết là các sản phẩm chất lượng hàng đầu, uy tín bậc nhất và quan trọng chính là giá cả vô cùng cạnh tranh.

Hãy tìm đến TRUNG SƠN nếu bạn có nhu cầu. Chúng tôi rất hân hạnh được phục vụ bạn.

Các Kỹ Thuật Pcr Và Ứng Dụng

(Restriction Fragment Length Polymorphisms) I. Giới thiệu

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Khi ủ DNA với enzim giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay.

II. Nguyên tắc chung

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzim cắt giới hạn (restriction enzim-RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.

III. Các enzim giới hạn (RE) 1. Giới thiệu

Enzim giới hạn được Werner Arber tìm thấy ở vi khuẩn vào năm 1962. Ông cho rằng các RE có khả năng rất đặc biệt đó là khả năng nhận biết DNA chủ và DNA lạ. Enzim này hạn chế sự nhân lên của DNA lạ khi chúng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn bằng cách cắt chúng ra thành từng đoạn một cách đặc hiệu, vì thế ông gọi là restriction có nghĩa là hạn chế. Với phát minh này ông cùng các cộng sự (Daniel Nathans và Hamilton O. Smith) đã giành giải thưởng Nobel vào năm 1978.

Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào sơ hạch (procaryote), một câu hỏi đặt ra là vì sao các RE chỉ cắt DNA của các phage mà không cắt DNA của tế bào vi khuẩn? Câu trả lời là nhờ Methylase đây là enzim giúp vi khuẩn có khả năng này, chính enzim này chịu trách nhiệm gắn nhóm metyl (CH 3) vào các nucleotides ở vị trí cắt của các RE trên DNA của vi khuẩn vì thế bảo vệ DNA của vi khuẩn khỏi sự phân cắt của RE. Tuy vậy đôi lúc methylase lại gắn nhằm cả nhóm metyl vào chính DNA của phage, điều này giải thích vì sao đối với các dòng vi khuẩn kháng phage vẫn có các tế bào bị phân hủy.

Enzim cắt giới hạn đầu tiên được phân lập vào năm 1968, cho đến nay có khoảng 3.400 RE được khám phá. Trong số này có khoảng 540 RE đã được thương mại hóa.

2. Tên gọi của enzim cắt giới hạn

Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên vi khuẩn từ đó RE được ly trích.

Hai chữ kế không viết hoa tương đương với tên loài của vi khuẩn. Cả 3 chữ nầy đều viết in nghiêng. Kế đến là chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện trong trường hợp nhiều RE được tìm thấy trong cùng một vi khuẩn.

Đôi khi còn có thêm chữ viết hoa (viết thẳng) để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng

VD : Escherichia coli Ry13

chi loài chủng

EcoRI: là enzym đầu tiên tìm thấy trên vi khuẩn E. coli

EcoRV: enzym thứ 5 tìm thấy trên vi khuẩn E.coli

3. Các loại enzim cắt giới hạn

Loại I: khi enzym nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA cách đó 1000-5000 nu và giải phóng độ vài chục nu.

Loại II: enzym nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.

Loại III: enzym nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó 20 nu.

III. Quy trình thực hiện RFLP bao gồm các bước:

+ Tách chiết và tinh sạch DNA

+ Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi RE

+ Phân tách DNA trên gel agarose

+ Southern Blotting

Chuyển DNA sang màng nylon

Chọn đoạn dò (probes), đánh dấu đoạn dò

Lai ghép gen (Hybridization)

Lập bản đồ gen (phân tích đa hình)

a. Nguyên tắc: Thành tế bào bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh. DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất Rnase. DNA được kết tủa trong Ethanol 100% và thu lại nhờ ly tâm.

b. Quy trình: Thực hiện theo qui trình được mô tả bởi Rogers và Bendich (1988) (qui trình CTAB) gồm các bước sau:

– Lấy lá của đối tượng cần nghiên cứu.

– Khử trùng bề mặt lá bằng cồn 70%, sau đó dùng kéo và kẹp (đã được khử trùng) cắt lá thành từng mảnh nhỏ rồi cho riêng vào các tuýp (mỗi mẫu riêng một tuýp khoảng 0,1g).

– Ngâm các tuýp và dụng cụ nghiền mẫu vào nitơ lỏng trong 10 phút.

– Cho mẫu vào máy nghiền, có tần số 27lần/giây, lập lại khoảng 3 lần.

– Cho thêm 1.000µl Extraction buffer (10ml EB +7µl β-Mercaptoethanol).

– Cho thêm 50µl SDS 10%.

– Ủ trong nước 65 o C trong 30 phút. Sau 5 phút trở mặt mẫu một lần.

– Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.

– Lấy 800µl dịch trong ở trên cho vào tuýp mới (bỏ phần cặn)

– Cho 800µl Isopropanol vào mỗi tuýp, lắc đều.

– Ủ mẫu ở -20 o C trong 2 giờ.

– Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, bỏ nước, lấy cặn.

– Cho thêm 400µl TE 0,1 vào, thêm 10µl RNase, ủ 20 phút ở 37 o C.

– Cho 400µl CTAB vào, ủ 15 phút ở 65 o C.

– Cho 800µl Chloroform/Isoamylalcohol, đảo nhẹ

(12ml Chloroform: 0,5ml Isoamylalcohol)

– Ly tâm 13.000rpm trong 5 phút.

– Lấy 700µl phần trong chuyển sang tuýp mới.

– Cho 1,4ml Ethanol 96% làm lạnh vào, lắc nhẹ, để 15 phút ở nhiệt độ phòng.

– Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, bỏ nước, lấy cặn.

– Cho 700µl Ethanol 70% làm lạnh vào, lắc nhẹ.

– Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, bỏ nước, lấy cặn.

– Lặp lại lần nữa với Ethanol 70% làm lạnh, thấm miệng tuýp trên giấy.

– Sấy chân không ở 45 o C trong 10 phút.

– Cho 200µl TE 0,1 vào, trữ mẫu ở -20 o C.

c. Xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ Nguyên tắc:

– Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm của các bazơ purin và pyrimidin.

– Đơn vị OD260 nm tương ứng nồng độ 50mg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi. Do đó nồng độ DNA trong mẫu được tính theo công thức sau: [DNA] (mg/ml) = OD260nm x 50 x Độ pha loãng – Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch có thể đo thêm giá trị OD 280nm. – Dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không lẫn protein) khi tỷ số : OD260nm/OD280nm nằm trong không 1.8 – 2.

2. Dùng enzim giới hạn cắt DNA Một số quy tắc khi thực hiện phản ứng cắt bằng RE

Nồng độ NaCl của dung dịch đệm, nếu phải sử dụng nhiều RE có nồng độ NaCl của dung dịch đệm khác nhau thì nên cắt với RE có nồng độ NaCl thấp trước rồi đến RE cần NaCl nồng độ cao hơn.

RE được bảo quản trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở -20 0 C, nên thêm vào phản ứng sau cùng, thời gian để bên ngoài càng ngắn càng tốt.

Thể tích phản ứng càng nhỏ càng có hiệu quả vì RE và DNA tiếp xúc với nhau càng tốt tuy nhiên phải bảo đảm thể tích RE không quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol nhiều sẽ gây ức chế hoạt động của RE.

3. Southern Blot a. Chuyển DNA sang màng nylon

– Cắt DNA thành các đoạn nhỏ bằng enzim giới hạn thích hợp.

– Ðiện di sản phẩm cắt trên gel Agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước.

– Làm biến tính DNA, khi DNA còn trên gel bằng dung dịch kiềm.

Ví dụ: có thể nhúng DNA vào trong dung dịch NaOH 0.5M : NaCl 1.5M, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn.

– Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai.

– Màng lai được sử dụng là màng nitrocellulose. Người ta cũng có thể sử dụng màng nylon. Màng nitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100µg DNA/cm 2, trong khi màng nylon có khả năng tiếp nhận 500µg DNA/cm 2. Mặt khác màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn. Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng hoạt tính mao dẫn trong khoảng vài giờ hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân không. Nếu dùng thiết bị thấm chân không thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất khoảng một giờ. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi.

Acid nucleic được chuyển lên màng lai nhờ lực mao dẫn.

b. Cách chọn đoạn dò (probes)

Probe (đoạn dò) là một sợi nucleic acid (hoặc ribonucleic acid) có trình tự xác định và được đánh dấu bằng các phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn nucleic acid khác có trình tự bổ sung với nó. Quá trình này dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA, được gọi là lai phân tử DNA. Các phương pháp cổ điển có sử dụng probe là Northern Blot (nhận diện bản RNA phiên mã), Southern Blot (nhận diện các phiên bản của gene). Công nghệ DNA chip và cDNA micro-arrays được thiết kế dựa trên nguyên tắc sử dụng các probe của các phương pháp lai phân tử nhưng cho phép nghiên cứu đồng loạt hàng nghìn gene khác nhau.

+ Probe có thể được thiết kế dựa trên những trình tự có sẵn tuỳ vào mục đích của từng thí nghiệm và các thông tin đã có.

+ Dựa trên trình tự genome của đối tượng nghiên cứu để nhận diện các bản sao của gen hoặc sản phẩm RNA của gen.

+ Dựa trên trình tự genome của các sinh vật có quan hệ gần gũi với đối tượng nghiên cứu nhằm tìm kiếm gen chức năng được bảo tồn qua quá trình tiến hoá.

+ Dựa trên trình tự amino acid của protein là sản phẩm của gene. Từ đó tìm kiếm trình tự trọn vẹn của gene mã hoá cho protein đó trên genome.

Trong quá trình thiết kế đoạn dò cần bảo đảm các yếu tố sau: 1) tính đặc trưng của probe, 2) không có hiện tượng lai chéo giữa các probe hoặc tạo cấu trúc không gian nội tại trong probe, 3) giá trị nhiệt độ biến tính (Tm) phải phù hợp khi thực hiện phép lai nhiều probe một lúc.

c. Cách ghi nhãn đoạn dò cho phương pháp lai Southern

Mẫu dò được đánh dấu trong một phản ứng sao chép DNA nhờ một dNTP mang chất đòng vị phóng xạ

Xem kết quả: phóng xạ tự ghi (autoradiograph)

Mẫu dò được đánh dấu trong một phản ứng sao chép DNA nhờ một dNTP mang chất phát huỳnh quang

Xem kết quả: máy đo huỳnh quang

Ưu điểm và khuyết điểm của kỹ thuật RFLP

– RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng dấu phân tử (marker) tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu.

– Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), và DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Hơn nữa hiện nay, ở nước ta nhà nước chưa cho phép nhập các chất phóng xạ.

– Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP.

IV. Ứng dụng:

– Trần Thanh Mến đã sử dụng kỹ thụât PCR-RFLP để nghiên cứu đa dạng sinh học các giống bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.) ở Việt Nam. Thực hiện phản ứng PCR với 2 cặp mồi ITS 1 và ITS 2; ITS 1 và ITS 4. Các sản phẩm PCR của từng cặp mồi được cắt bằng 6 enzim giới hạn SmaI, EcoRI, HindIII, PstI, BamHI, KpnI. Dựa vào kết quả thu được ta xác định được mối tương quan di truyền của các giống cây này.

– Bác sĩ Lê Nhật Minh, Phan Lê Thanh Hương và Lê Thị Kim Tuyến đã sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định một số vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em.Kỹ thuật PCR sử dụng một cặp mồi chung cho phép nhân lên một đoạn DNA có kích thước 996bp trên gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom của 11 loài vi khuẩn, sau đó sản phẩm PCR được cắt bằng enzim Hae III kết quả đã phân biệt được 11 loài vi khuẩn chuẩn khác nhau và xác định chính xác 9 loài vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em.(Trích Hội nghị Khoa học – 2006 – Viện Pasteur TP.HCM)

KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) I. Giới thiệu

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen). Đây là kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao, kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 tại công ty Cetus; mặc dù nguyên tắc này đã được mô tả chi tiết trước đó một thập niên bởi Khorana và ctv., (Kleppe và ctv., 1971; Panet và ctv., 1974), và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993. Kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.

II. Nguyên lý Nguyên lý nhân gen trong tế bào:

DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định lên đặc tính của cơ thể (ngoại trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA). Đối với những sinh vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dưới dạng kết hợp với protein thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Ngoài ra, tại các cơ quan tử như ty thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid.

Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thường chỉ được nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏi phải có mặt enzim DNA polymerase, sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit. Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được mở xuắn tách thành các sợi DNA sợi đơn. Dưới tác dụng của enzim DNA polymerase, quá trình tổng hợp DNA được xảy ra theo cách gắn lần lượt các nucleotit vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.

Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:

+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase.

+ Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp.

+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động.

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100 0 C. Ở nhiệt độ này DNA sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng).

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài.

III. Máy PCR

Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, để thực hiện được phản ứng PCR các nhà khoa học gặp 2 trở ngại lớn:

+ Lúc đầu enzim Klenow polymerase được sử dụng bị phân hủy ở 95 0 C nên phải thêm enzim vào ống nghiệm sau mỗi chu kỳ ở giai đoạn phân tách chuỗi DNA.

+ Để thay đổi chu kỳ nhiệt các nhà khoa học phải sử dụng 3 water baths ở 3 nhiệt độ khác nhau. Khi đếm và thay đổi 30 đến 35 chu kỳ nhiệt khá phiền phức, dễ gây sai sót.

Việc tìm ra enzim Taq polymerase và máy PCR tự động thay đổi các chu kỳ nhiệt đã làm cho kỹ thuật này phát triển nhanh và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu (McPherson và ctv., 1992).

Một cách tổng quát, máy PCR gồm các bộ phận chính như sau :

+ Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện.

+ Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện.

Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Ðể làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ PCR, có hai phương pháp :

(1) Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một hệ thống của máy làm lạnh. Với phương pháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạt động âm thanh cũng khá ồn ào.

(2) Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu quả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử : Khi áp hai mãnh kim loại vào nhau và khi có sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại thì sẽ sinh ra một dòng điện và chính sự lưu thông của dòng điện này khi đo lường sẽ phản ánh sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại. Hiệu quả Peltier ngược lại vận hành theo kiểu ngược lại, nghĩa là khi tạo ra một dòng điện giữa hai mãnh kim loại thì sẽ tạo ra được một sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh : bên này nóng, bên kia lạnh. Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai mãnh cũng thay đổi ngược lại: bên này lạnh, bên kia nóng. Các máy chu kỳ nhiệt hiện nay đều được chế tạo dựa theo phương pháp thứ hai này, nhờ vậy mà máy trở nên rất gọn nhẹ, giá thành rẽ hơn gấp nhiều lần so với trước đây.

IV. Chuẩn bị mẫu DNA

Mẫu DNA của đối tượng cần nghiên cứu được ly trích và tinh sạch, sau đó trữ mẫu ở – 2 00C.

V. Thiết kế mồi

– Mồi là những đoạn oligonucleotide (18-24 base) bổ sung với trình tự trên DNA, gồm có mồi xuôi và mồi ngược

Mồi xuôi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã.

Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp với mạch mã của DNA và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên mã.

+ Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc

+ Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau, thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30%< G+C<70%

+ Mồi phải bảo đảm đủ dài để bắt cặp chính xác.

+ Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.

+ Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (<3000 nu

tốt nhất là dưới 1000 nu)

HÌNH: Sự hình thành nút cài tóc do mồi chứa trình tự đối xứng bậc hai

ách tính nhiệt độ bắt mồi:

– Đối với mồi ≤ 20 nucleotide thì nhiệt độ gắn mồi được tính như sau:

Tm = [2(A+T) + 4 (G+C)]

* Ví dụ, đoạn mồi CAGCAAATATCTGTCCTTAC thì nhiệt độ gắn mồi:

Tm = [2(6+6) + 4(2+6)] = 56 0 C

Tm = 22 + 1.46[ 2(G + C) + (A + T)] 0 C

VI. Điều kiện phản ứng PCR

Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau đây:

1. Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzim cắt giới hạn…Nói cách khác là không chứa bất kỳ một thành phần nào khác.

2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR:

Dung dịch đệm cho PCR là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng phản ứng PCR.

Thành phần dung dịch đệm của phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại enzim DNA polymerase sử dụng trong PCR, thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM, KCl50mM và MgCl 2 1.5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide nữa. Trong các thành phần trên, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl 2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phản ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl 2 thích hợp nhất.

Nồng độ MgCl 2 có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ion Mg 2+ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi. Nồng độ MgCl 2 cao sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl 2 quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR.

3. dNTP (deoxy nucleoside triphosphate), tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích. dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là Adenine (dATP) hay Thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay Guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3′ của chuỗi bổ sung trên chuỗi DNA đích. Năng lượng để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do tại sao phải là dNTP chứng không phải là dNDP (diphosphate) hay dNMP(monophosphate).

Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).

Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu

của phản ứng

Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. (2) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3′ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi

5. Enzim DNA polymerase (Taq)

Là enzim xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp, phải là men polymerase chịu được nhiệt độ cao.

Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên Quốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệt sống trong suối nước nóng 80-90 0C. Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao, có tên là Thermus aquaticus. Hai mươi năm sau, các nhà khoa học của tập đoàn Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấy rằng DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Taq-polymerase) có khả năng giải quyết vấn đề của enzim biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Taq-polymerase. Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR như Vent– polymerase (Tli-polymerase), Pfu– polymerase, rTth …

6. DNA mẫu (DNA template) là mẫu DNA mà chúng ta sẽ khuếch đại. Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu. DNA khuôn có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất.

VII. Chu kỳ nhiệt

Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).

* Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng : 1-2 phút.

* Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính khoảng 45-60°C. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp từ 1-2phút.

* Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc 1000bp/ 1 phút .

Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo.

Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

VI. Các ứng dụng

Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học đến sản xuất và đời sống xã hội. Những ứng dụng chính của kỹ thuật PCR là:

– Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu

– Phát hiện đột biến

– Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử

– Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm

– Chọn giống vật nuôi, cây trồng

– Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn

– Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân tử Y học – Khoa học hình sự.

– Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus

– Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền

– Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

– Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…

+ Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc. 2003. Xác định giới tính ở heo bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí di truyền & ứng dụng ,Số 4.

+ Tang và ctv (2000) đã dùng kỹ thuật PCR competitive để định lượng WSSV (White Spot Syndrome Virus) nhiễm trong Penaeus monodon Fabricius để phân loại giai đoạn nhiễm WSSV thành mức độ nhẹ, trung bình và nặng, từ đó có cách xử lý thích hợp làm giảm thiệt hại trong nghề nuôi tôm (Tang, K. F. J., Lightner D. V.,2000. Quantification of white spot syndrome virus DNA throught a competitive polymerase chain reaction. Aquaculture, 189:11-21)

+ Phát hiện nhanh Salmonella spp. trong thực phẩm (Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên và cộng sự. Viện Pasteur TP.HCM)

+ Áp dụng kỹ thuật PCR sản xuất Bộ KIT chuẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm, bệnh vàng lá gân xanh. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học- Đại học Cần Thơ.

CÁC KỸ THUẬT IN DẤU DNA (DNA FINGERPRINTING)

I. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

1. Giới thiệu

Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 (Welsh và McClelland; William và ctv.). Dùng nghiên cứu sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau. Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm 10-mer có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen của hai loài khác nhau sẽ cho những đoạn băng trên gel khác nhau, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các giống cây.

2. Nguyên tắc

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch đại. Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và mồi. Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen. Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch

Dùng nhiều primer khác nhau sẽ khuếch đại nhiều đoạn gen với kích thước khác nhau, kết quả này được thể hiện trên gel với nhiều băng (band) ở những vị trí khác nhau, các băng đa hình được ghi nhận và từ đó có thể vẽ được bản đồ trên một quần thể đang phân ly.

Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, sẽ khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR. Sinh vật khác nhau ít nhiều sẽ khác nhau về kiểu gen _ đa dạng về sinh học, thì với một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuyếch đại sẽ có kích thước khác nhau.

Là đoạn ngắn oligonucleotide đơn (10 nu) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lượng G+C từ 60-70%, và không có đầu tự bổ sung.

Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng một số lượng lớn các mồi ngẫu nhiên.

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều mồi ngẫu nhiên được tổng hợp nhân tạo.

3. Qui trình thực hiện kỹ thuật RAPD

– Thiết kế mồi

– Chuẩn bị mẫu DNA: mẫu DNA được ly trích phải đủ thuần, Ít tạp chất.

– Pha mix cho phản ứng PCR với các thành phần theo thứ tự sau:

H 2 O tiệt trùng, Buffer, dNTP tổng số, mồi xuôi, mồi ngược, Taq polymerase, DNA mẫu.

– Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp

– Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt của thang chuẩn

– Phân tích kết quả bằng phần mềm BioPRO.

– Xác định tính di truyền bằng các phần mềm thông dụng. Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hay cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.

– Hệ số đồng dạng di truyền có thể được tính theo công thức của M. Nei & Li (1979)

N i: số vạch của giống i

N j: số vạch của giống j

N ij: số vạch chung của 2 giống i và j

4.Ứng dụng

Kỹ thuật RAPD được ứng dụng đê nghiên cứu đa dạng di truyền của các giống.

Thiết lập bản đồ di truyền: từ quần thể cha mẹ F1 và quần thể phân ly F2, người ta có thể đánh giá các băng hiện diện , sau đó dùng phần mềm phổ biến hiện nay là Mapmarker để thiết lập bản đồ di truyền.

Sử dụng kỹ thuật RAPD “Nghiên cứu đa dạng sinh học của giống cây có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang”. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng 4 mồi A02, A04, A11 và A13 trong phân tích đa dạng di truyền ; kết quả có 49 dấu phân tử được ghi nhận. Từ đó vẽ được giản đồ phả hệ của các giống cây này. Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn và Nguyễn Văn Được. Tạp chí Khoa học 2004:1, trang 105-114.

Phương pháp RAPD có những nhược điểm:

Sự xuất hiện các băng tính trội, điều đó không phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử.

Tính lập lại không cao do primer là primer ngẫu nhiên và phụ thuộc điều kiện phản ứng PCR.

Trở ngại trong việc giải thích các băng có cùng tóc độ di chuyển.

Những ưu điểm nổi bật của kỹ thuật RAPD:

Phương pháp phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền

Đơn giản, không dòi hỏi kỹ thuật cao.

Tương đối rẽ tiền so với các phương pháp khác như RFLP, SSR…

Không dùng đồng vị phóng xạ.

kỹ thuật AFLP

I. Giới thiệu

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzim giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP là một trong những kỹ thuật in dấu DNA được phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995. Kỹ thuật này là một công cụ hữu ích để xác nhận nhiều loci của đa hình DNA mà không cần phải biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng (Michelmore và ctv., 1998), phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau (Breyen và ctv., 1997; Cervera và ctv.,1996)

II. Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp AFLP cũng giống như RFLP, điểm khác biệt cơ bản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot ), do vậy thực hiện nhanh hơn. Kỹ thuật AFLP gồm hai nội dung cơ bản là:

– Cắt DNA bằng enzim giới hạn có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên các đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước. Cặp enzyme thường được dùng nhất là E coRI – M se I. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme.

– Khuếch đại đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác nhau. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.

I. Kỹ thuật AFLP

1. Qui trình

Qui trình thực hiện AFLP gồm bốn bước:

Bước 1: Digestion

Dùng 2 enzim giới hạn EcoRI (ít có = 4096 bases) có trình tự nhận biết 6 base và MseI (thường có = 256 bases) có trình tự nhận biết 4 base, cắt DNA khuôn thành những phân đoạn. Hai enzym giới hạn này được dùng để sắp xếp lại DNA nhờ kết hợp với 2 adaptor có cấu trúc làm cho dây DNA không trở lại hình dạng ban đầu

Vị trí cắt của enzim

Eco RI = 5′-G AATT C-3′

3′-C TTAA G-5′

Mse I = 5′-T TA A-3′

3′-A AT T-5′

Bước 2 : Ligation

Nối với EcoRI adaptor và Mse I adaptor, là những oligonucleotide sợi đôi gắn vào 2 đầu phân đoạn DNA. Cấu trúc của 2 adaptor như sau :

Eco RI-adaptor

5′-CTCGTAGACTGCGTACC

CTGACGCATGGTTAA-5′

Mse I-adaptor

5′-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5′

Bước 3 : Tiền khuếch đại

– Chạy PCR với các mồi (primer) chọn lọc, các mồi này được cấu tạo gồm 3 phần : trình tự nồng cốt (CORE) + trình tự theo enzim (ENZ) + trình tự chọn lọc (EXT) (theo định hướng của người nghiên cứu ký hiệu là NNN, có thể là TGA hoặc AAC hoặc CTG…)

Nhờ vậy, chỉ những phân đoạn có nu bổ sung được với nu chọn lọc được nhân lên. Sự khuếch đại chọn lọc như vậy làm giảm số lượng phân đoạn hàng ngàn lần. Chỉ những đoạn DNA ngắn có một đầu là primer MseI và một đầu là primer EcoRI là được khuếch đại đáng kể, các đoạn có hai đầu là EcoRI bị mất đi do số lượng ít và hai đầu là Mse I tự tạo thành vòng nhỏ DNA do cạnh tranh với primer. Sản phẩm tiền phản ứng được pha loãng và được dùng làm vật liệu để khuếch đại với đoạn mồi chọn lọc màu huỳnh quang.

Bước 4 : Khuếch đại

Sản phẩm PCR của bước tiền khuếch đại được dùng làm khuôn cho bước khuếch đại sau đó, sử dụng primer có gắn 3 nu chọn lọc ở đầu 3′ và chỉ EcoRI primer được đánh dấu huỳnh quang ở đầu 5′. Vì vậy, chỉ những sợi chứa Eco RI được phát hiện trên máy ABI 310. PCR được xảy ra với thông số miêu tả bởi Cervera và ctv (1996). Phản ứng bắt đầu với nhiệt độ cao gắn mồi tối hảo cho mồi chọn lọc. Nhiệt độ này giảm dần sẽ làm tăng sự kết hợp. Sử dụng primer gắn với 3 nu chọn lọc sẽ giúp hạn chế việc bắt cặp sai (mismatch), chỉ nhân lên một số lượng lớn những băng chuyên biệt.

Ngoài ra, việc khuếch đại qua 2 bước có những thuận lợi hơn khuếch đại trực tiếp như:

– Phổ diện rõ hơn vì không có quá nhiều loại marker.

– Qua bước tiền khuếch đại, tạo lượng lớn DNA khuôn cho sự khuếch đại dễ dàng và hiệu quả hơn.

– Sau khi xong phản ứng, mẫu được biến tính bằng cách thêm một lượng tương đương thể tích 15µl dung dịch đệm Formamide và đun nóng 5′ ở 95 o C. 1ml mỗi mẫu được nạp tự động vào ống mao quản (capilary) polymer ABI 310.

Hình : các bước thực hiện kỹ thuật AFLP

2. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật AFLP

Ưu điểm của kỹ thuật AFLP

– AFLP không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen.

– Có tính lặp lại cao hơn RAPD và chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ DNA ban đầu (2.5pg-25ng)

– Khuếch đại có chọn lọc một lượng lớn các đoạn DNA đa hình (polymorphism) trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng giữa các quần thể có quan hệ gần nhau.

– Không cần biết trước trình tự DNA của gen cần nghiên cứu, không cần sử dụng nhiều loại primer.

– Là kỹ thuật in dấu DNA còn khá mới lạ nhưng rất hiệu quả, có thể in dấu DNA của bất kỳ nguồn gốc phức tạp nào từ sinh vật sơ hạch, thực vật, động vật đến con người.

Nhược điểm

– Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.

– Qui trình dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực hiện.

– Lệ thuộc nhiều vào thao tác ở những bước đầu để có được phổ diện các phân đoạn DNA lý tưởng.

III. Ứng dụng

– In dấu DNA, lập bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác (Vos và ctv., 1995).

– Tạo nhóm liên kết di truyền giữa các giống.

– Đánh giá mức độ liên hệ di truyền hoặc sự khác nhau giữa các giống.

– Là công cụ hiệu quả để phát hiện tính chất đa hình nên dễ dàng nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể.

Travis và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật AFLP để đánh gía sự đa dạng di truyền giữa tất cả những quần thể của Astragalus cremnophylax . Chín loại mồi đã được sử dụng để cho ra 325 vạch của 143 cá thể được thu mẫu từ ba quần thể. Từ kết quả phân tích được, Travis và cộng tác viên (1996) có thể biểu thị đặc điểm của sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của chúng và đưa ra hướng quản lý việc bảo tồn loài cây này.

(Travis, S. E., J. Maschinski and P. Keim, 1996. An analysis of genetic variation in Astragalus cremnophylax a critically – endangered plant, using AFLP marker. Molecular Ecology 5:735-745)

Van Droogenbroek B. et al., 2002. kỹ thuật này được ứng dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các giống đu đủ trồng và đu đủ hoang dại (Caricaceae) ở Ecuador

(Van Droogenbroek B., Breyne P., Goetghebeur P., Romeijin Peter E., Kyndt T., Gheysen G., 2002. AFLP analysis of genetic relationships among papaya and its wild relative (Caricaceae) from Ecuador. Theor Appl Genet 105: 289-297)

Nguyễn Thị Loan Anh và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật AFLP để nghiên cứu đa dạng sinh học các giống bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.) ở Việt Nam. Kết quả tổng số có 60 dấu phân tử ghi nhận được, trong đó có 6 dấu phân tử xuất hiện ở tất cả các giống bưởi nghiên cứu, 2 dấu phân tử xuất hiện với tần suất 1/40 giống.

(Nguyễn Thị Loan Anh, Đỗ Tấn Khang, Trần Nhân Dũng, Hà Thanh Toàn, Tina Kyndt, Godelieve Gheysen, Marcelle Holsters, 2008. Nghiên cứu đa dạng sinh học các giống bưởi ( Citrus maxima (Burm.) Merr.) ở Việt Nam. Hội nghị khoa học cây ăn trái quan trọng ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. NXB Nông Nghiệp TPHCM).

Sự Khác Biệt Giữa Pcr Sao Chép Ngược Và Pcr Thời Gian Thực Là Gì? Họ Có Giống Nhau Không?

Sự khác biệt giữa PCR sao chép ngược và PCR thời gian thực là gì? Họ có giống nhau không?

Họ rất nhiều không giống nhau. Nhưng tôi hiểu câu hỏi đến từ đâu: cả hai có thể được viết tắt là RT- PCR. Reverse transcriptase xuất hiện đầu tiên, sau đó Real-Time đã đánh cắp từ viết tắt.

PCR phiên mã ngược (RT-PCR):

Mẫu: RNA.

Enzyme: Phiên mã ngược.

Sản phẩm cuối: dimer DNA-RNA.

Được sử dụng để tạo mẫu DNA từ RNA cho phản ứng PCR tiếp theo. Sẽ không khuếch đại mẫu, chỉ để chuẩn bị mẫu DNA để khuếch đại. Sẽ được theo sau bởi phản ứng khuếch đại PCR (có thể bằng PCR thời gian thực hoặc thông thường).

PCR thời gian thực (RT-PCR):

Bản mẫu: DNA

Enzyme: DNA polymerase

Sản phẩm cuối: DNA

Mục đích: đo lường sự khuếch đại của DNA trong quá trình. Là một phần của thẻ huỳnh quang hỗn hợp phản ứng được thêm vào. Tín hiệu huỳnh quang phát ra khi được kết hợp trong chuỗi xoắn DNA sợi đôi như một sản phẩm PCR. Sau mỗi chu kỳ PCR, huỳnh quang được kiểm tra và so sánh với phản ứng kiểm soát dương tính. Do đó, số lượng DNA có thể được đo sau mỗi chu kỳ (theo thời gian thực). Phản ứng PCR thông thường không cho phép – bạn đo lượng DNA sau khi kết thúc phản ứng.

Real-Time PCR là một công cụ rất hữu ích khi bạn muốn đo lường hiệu quả của phản ứng PCR. Hiệu quả giảm sau khi đạt được nồng độ nhất định và các chu kỳ sau không đạt được hiệu quả. Ngoài ra, điện di gel agarose sau đó có thể không cần thiết với PCR thời gian thực.

Quá trình có thể có nhược điểm, mặc dù:

Nó đắt hơn nhiều. Nó đòi hỏi phải có trang bị chuyên dụng. Sản phẩm này có thể không phù hợp với các ứng dụng tiếp theo như nhân bản.

Nhưng này, bạn nhận được một câu trả lời định lượng ngay lập tức!

Điều đầu tiên, bộ não sẽ dễ dàng phân biệt hơn nếu chúng ta đề cập đến transcriptase-PCR ngược là rtPCR và gọi PCR thời gian thực là PCR định lượng (qPCR).

rtPCR về cơ bản bắt đầu bằng cách tạo DNA bổ sung (cDNA) từ mRNA. Để làm điều này, enzyme phiên mã ngược được yêu cầu. Phiên mã ngược tương tự như DNA polymerase, chỉ có nó đọc RNA để sắp xếp chuỗi bổ sung DNA chuỗi đơn. RNase H là một endonuclease phải được thêm vào để loại bỏ RNA khỏi chuỗi cDNA. Từ thời điểm này, DNA polymerase 1 được thêm vào, và PCR bình thường xảy ra để tạo ra một chuỗi DNA khác bổ sung cho cDNA.

qPCR, đối với hầu hết các phần, giống như PCR và rtPCR thông thường. Sự khác biệt là qPCR sử dụng các phương pháp định lượng như ghi nhãn huỳnh quang để theo dõi quá trình sản xuất DNA trong thời gian thực của Hồi, tên vì thế. rt-qPCR là một quá trình trong đó DNA được tổng hợp từ mRNA, nhưng thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc đầu dò được thêm vào cho mỗi chu kỳ tổng hợp DNA. Ý tưởng chung là sự phát triển mạnh mẽ khi nhiều DNA được tổng hợp.

Điều thú vị về việc tạo cDNA từ mRNA là DNA đủ ổn định để được nối vào một vec tơ tiêu hóa, sau đó có thể được chuyển thành tế bào chủ. Sau đó, tế bào chủ có thể biểu thị sản phẩm của gen mục tiêu.

Bạn đang đọc nội dung bài viết Máy Pcr Là Gì? Công Dụng Của Máy Pcr Pockit Cầm Tay trên website Cuocthitainang2010.com. Hy vọng một phần nào đó những thông tin mà chúng tôi đã cung cấp là rất hữu ích với bạn. Nếu nội dung bài viết hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!