Top 10 # Xem Nhiều Nhất Phương Pháp Elisa Mới Nhất 5/2023 # Top Like

HIV ( human immunodeficiency virus, có nghĩa virus suy giảm miễn dịch ở người) là một lentivirus (thuộc họ retrovirus) có khả năng gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải một tình trạng làm hệ miễn dịch của con người bị suy giảm cấp tiến, tạo điều kiện cho những nhiễm trùng cơ hội và ung thư phát triển mạnh làm đe dọa đến mạng sống của người bị nhiễm.

Elisa là phương pháp xét nghiệm HIV miễn dịch gắn men và nó có độ nhạy rất cao. Đây là phương pháp xét nghiệm được khá nhiều người lựa chọn, vậy xét nghiệm HIV bằng phương pháp elisa là gì?

– Xét nghiệm elisa dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó thì mỗi một kháng thể sẽ được gắn với một enzym. Khi chúng ta cho thêm bệnh phẩm có chứa kháng thể thì nó sẽ phản ứng và enzym sẽ phân hủy thành máu, thông qua cường độ máu thì sẽ biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể Hiv.

– Huyết thanh cần thử ủ với kháng nguyên tinh chế cố định trên giá đỡ 30 phút. Sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulin người gắn Enzym. Nếu kháng thể trong huyết tương có xuất hiện sẽ gắn vào kháng nguyên điều chế và rửa không mất đi. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.

– Độ nhạy cao, giá thành không quá đắt. Bệnh phẩm là máu, nước tiểu, nước bọt. Elisa từ máu 4h là cho kết quả nhưng phải làm cùng nhiều mẫu xét nghiệm cho đỡ tốn kém nên có thể phải chờ 1-2 tuần mới có kết quả. Dương tính giả 0,5-2%.

Xét nghiệm không có giá trị với phơi nhiễm trong thời gian cửa sổ.

Elisa(+) phải bổ sung bằng Western blot.

Elisa (-) phải xem xét hết giai đoạn cửa sổ mới có giá trị.

Qua đó ta thấy việc phát hiện sớm và điều trị HIV bằng xét nghiệm HIV là vô cùng quan trọng trong chẩn đoán và điều trị HIV !

Quy Trình Tìm Giun Đũa Chó Bằng Phương Pháp Elisa

Hiện nay việc chẩn đoán bệnh ký sinh trùng bao gồm nhiều phương pháp giúp phát hiện nhiều  loại ký sinh trùng đang “ký sinh” trên cơ thể làm hại sức khỏe để từ đó đưa ra cách loại bỏ chúng. Tùy vào diễn biến cũng như triệu chứng của bệnh nhân, bác sĩ sẽ chỉ định một số phương pháp chẩn đoán đối với từng bệnh nhân. Hầu hết tất cả các bệnh viện và phòng khám hiện nay điều sử dụng kỹ thuật Elisa.

Kỹ thuật Elisa phát hiện hầu hết các loại ký sinh trùng xâm nhập vào cơ thể người thông qua đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với  loại ký sinh trùng đó. Tuy nhiên tùy theo mỗi loại ký sinh trùng mà độ đặc hiệu của kháng thể đáp ứng với các căn nguyên đó. Một số kít Elisa phát hiện ký sinh trùng như giun đũa chó,… có độ chính xác rất cao, độ đặc hiệu đạt 93.3 %.

Phương pháp xét nghiệm tìm giun đũa chó là miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme. Kỹ thuật xét nghiệm phức hợp Sandwich. Toxocara Elisa Kit là xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme (Elisa) dùng để phát hiện định tính kháng thể IgG kháng Toxocara trong mẫu huyết thanh người.

Nguyên tắc xét nghiệm

Vi giếng được phủ kháng nguyên ngoại tiết của ấu trùng Toxocara. Trong bước ủ đầu tiên với huyết thanh của bệnh nhân, nếu có bất kỳ kháng thể hiện, chúng sẽ liên kết với các giếng phủ kháng nguyên trong quá trình ủ đầu tiên. Tiếp theo, các giếng phải được rửa bỏ những phần còn lại cảu mẫu, và thêm vào là enzyme liên hợp. Trong lần ủ thứ hai, enzyme liên hợp sẽ liên kết với bất kỳ kháng thể có mặt. Sau khi rửa lần 2, chất tạo màu (tetramethylbenzidine hoặc TMB) được thêm vào. Với sự hiện diện của enzyme liên hợp, peroxidase xúc tác sử dụng peroxide để biến chất tạo màu thành màu xanh. Màu xanh chuyển sang màu vàng sau khi bổ dung dịch dừng phản ứng STOP. Kết quả được đọc bằng mắt hoặc sử dụng máy đọc Elisa.

Chuẩn bị

Trước khi sử dụng, ta mang tất cả thuốc thử và mẫu để tại nhiệt độ phòng (15-25 oC).

Dịch rửa đậm đặc (20X) có thể kết tủa khi bảo quản trong tủ lạnh, nhưng sẽ trở thành dung dịch khi đưa về nhiệt độ phòng và trộn. Đảm bảo rằng dịch rửa đậm đặc (20X) là hoàn toàn thành dung dịch trước khi pha loãng thành nồng độ hoạt động.

Quy trình xét nghiệm

Lưu ý:

Chắc rằng mẫu và thuốc thử phải để tại nhiệt độ phòng (15-25 oC).

Khi chạy xét nghiệm, cố gắng tránh tạo bọt trong giếng. Bọt có thể ảnh hưởng đặc tính kỹ thuật và việc đọc kết quả cuối. Đập giếng ngược lên khăn thấm sau mỗi bước để giúp giảm thiểu việc tạo bọt trong giếng.

Chứng âm và dương được cung cấp đã pha loãng trước. Không pha loãng thêm.

Các bước tiến hành

Bẻ ra số giếng cần thiết (hai cho đối chứng cộng với số lượng mẫu) và đặt trong khung giữ thanh vi giếng.

Pha loãng huyết thanh bệnh nhân tỷ lệ 1:64 với đệm pha loãng.

Thêm 100 µl chứng âm vào giếng # 1,100 µl chứng dương vào giếng # 2 và 100 µl mẫu xét nghiệm đã pha loãng vào các giếng còn lại.

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó rửa 5 lần. Sau lần rửa cuối, Đập giếng lên khăn giấy để loại bỏ nước còn sót lại.

Thêm 100µl Enzyme Liên hợp vào mỗi giếng.

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó rửa 5 lần. Sau lần rửa cuối, Đập giếng lên khăn giấy để loại bỏ nước còn sót lại.

Thêm 100µl chất bắt màu TMB vào mỗi giếng.

Ủ ở nhiệt độ phòng xét nghiệm trong 5 phút.

Thêm 100µl dung dịch dừng phản ứng STOP vào mỗi vi giếng. Trộn bằng cách gõ nhẹ khung giữ bằng ngón tay khoảng 15 giây.

Đọc kết quả trong vòng một giờ sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng.

Quy trình rửa cho máy rửa tự động và bán tự động

Thực hiện rửa (5) lần trên một bước thay vì ba lần.

Thiết lập máy để “ngâm” một phút giữa mỗi bước rửa.

Sau mỗi bước rửa, đập giếng lên khăn thấm.

Đọc kết quả

Máy đọc Elisa: đọc mức Zero với không khí. Thiết lập đọc bước sóng kép tại 450/620-650 nm.

Giải thích kết quả – máy đọc Elisa

Đọc Elisa mức Zero với không khí. Đọc tất cả các giếng tại 450/650 – 620 nm.

Dương tính: kết quả đọc độ hấp thụ cao hơn 0,3 đơn vị OD

Âm tính: kết quả đọc độ hấp thụ thấp hơn 0,3 đơn vị OD.

Giải thích kết quả – đọc bằng mắt

So sánh kết quả với đối chứng, kết quả được cho là dương tính nếu sự tạo màu rõ rệt và có ý nghĩa.

Quản lý chất lượng

Sử dụng thuốc chứng cho phép xác nhận độ ổn định của bộ xét nghiệm. Các bộ xét nghiệm không nên được sử dụng nếu bất kỳ thuốc chứng nào vượt ra khỏi phạm vi. Giá trị dự kiến cho các thuốc chứng là:

Chứng âm: 0,0 đến 0,3 đơn vị OD.

Chứng dương: 0,5 đơn vị OD trở lên.

Chẩn đoán nhiễm Toxocara không nên được thực hiện chỉ dựa trên kết quả của một xét nghiệm ELISA Toxocara, mà phải kết hợp với các dấu hiệu lâm sàng và triệu chứng khác và những phát hiện trong phòng thí nghiệm khác.

Các yếu tố dịch tễ học, lâm sàng, vùng đặc hữu, và kết quả xét nghiệm khác cần được xem xét khi thực hiện một chẩn đoán.

Bảo quản mẫu

Các chất phản ứng, thanh vi giếng và các thành phần đóng chai bảo quản tại 2 – 8ºC.

Bình tia chứa đệm rửa pha loãng có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng.

Liên hệ xét nghiệm và điều trị ký sinh trùng giun sán tại Phòng khám bệnh giun sán, 76 Trần Tuấn Khải, phường 5, quận 5. Là phòng khám Chuyên khoa Nội Ký sinh trùng uy tín tại TP. HCM. Giờ mở của từ 7 giờ sáng đến 5 giờ chiều, hoạt động từ thứ 2 đến thứ 7, nghỉ ngày CN. Phòng khám do các bác sĩ Chuyên khoa Ký sinh trùng giàu kinh nghiệm thành lập, trực tiếp khám và điều trị bệnh giun sán, đảm bảo mọi quyền lợi cho người bệnh./.

Bác sĩ. Lê Giang

PHÒNG KHÁM KÝ SINH TRÙNG

76 TRẦN TUẤN KHẢI, TP.HCM

TRỊ MẨN NGỨA DA DO GIUN SÁN

 ĐC: 76 Trần Tuấn Khải, P.5, Q.5, TP. HCM

Bác sĩ của bạn: 0877688286 

Làm việc từ thứ 2 – 7, Nghỉ ngày CN

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

(1) Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;

(2) Kháng thể – antibody (KT) biết trước được “rửa” qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme;

(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.

Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT. Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.

Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate).

– Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa;

– Phương thức gắn đặc hiệu (“sandwich” ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra

KT đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp KT-KN có thể sảy ra.

Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp này.

Giữa các bước của ELISA, các protein và các KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng “rửa”. Sau bước “rửa” cuối cùng, chỉ còn KT liên kết với KN được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với KT trong phức hợp KT-KN. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra.

Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA.

Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định KN, KT 1. Trong phương pháp này, KT hay HN có gắn chất đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của chúng được xác định thông qua tín hiệu phóng xạ. Tuy vậy, các chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp mới trong đó tín hiệu được phát ra không phải nhờ phóng xạ. Khi đó người ta đã biết rằng một số loại enzyme như các peroxidase phản ứng với một số cơ chất nhất định như Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sẽ phát màu. Màu sinh ra từ các phản ứng này có thể được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ thị).

Tuy nhiên, để tín hiệu này được sử dụng như chất phóng xạ trong radioimmunoassay, tín hiệu màu phát ra phải đồng nghĩa với sự có mặt của KT hay KN. Chính vì vậy, giải pháp được đưa ra là enzyme sẽ được gắn với KN hay KT. Kỹ thuật gắn kết enzyme với KN hay KT được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce 2. Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn KN và KT trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các đĩa) nhờ đó mà KN hay KT không được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa trôi 3.

Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Anton Schuurs và Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) dựa trên tất cả những bước phát triển nói trên. Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971 4,5.

Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KT (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này.

Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):

Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT; (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được.

1. Yalow R, Beón S (1960). “Immunoassay of endogenous plasma insulin in man”. Journal of Clinical Investigation 39: 1157-75.

2. Lequin R (2005). “Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).” Clinical Chemistry 51 (12): 2415-8.

3. Wide L, Porath J. Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies. Biochem Biophys Acta 1966;30:257-260

4. Engvall E, Perlman P (1971). “Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G”. Immunochemistry 8 (9): 871-4.

5. Van Weemen BK, Schuurs AH (1971). “Immunoassay using antigen-enzyme conjugates.”. FEBS Letters 15 (3): 232-6

Tiền thân của ELISA là kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay – RIA) được phát triển từ những năm 1960s bởi Rosalyn Sussman Yalow khi thực hiện thí nghiệm miễn dịch phóng xạ để xác định nồng độ insulin trong huyết tương. Nhờ phát minh này mà bà được tặng giải Nobel năm 1977. Ngày nay phương pháp này được dùng để xác định hocmon, thuốc, glucagon, globulin MD, các kháng nguyên virut… Đến năm 1966 Wide và Porath có những nghiên cứu mới tạo nền tảng cho ELISA. Năm 1971, kỹ thuật ELISA được hoàn thiện và phát minh bởi Peter Perlmann, Eva Engvall tại đại học Stockholm – Thụy điển. Đến năm 1975 các kháng thể đơn dòng của thế hệ đầu tiên ra đời.

ELISA là phương pháp miễn dịch hấp phụ sử dụng enzyme liên kết dùng để phát hiện những hợp chất mong muốn (kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm), dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên (Antigen) và kháng thể (Antibody), trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thuỷ phân cơ chất thành một chất có màu. Thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.

Kháng nguyên (Antigen):

Là một protein hoặc carbohydrate mà khi tiêm vào động vật sẽ sinh ra kháng thể.

là các globulin trong máu của động vật, có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó.

Enzyme:

là một chất có thể phản ứng với nồng độ thấp như chất cần phân tích tạo thành phản ứng đặc hiệu. Thông thường trong ELISA, enzyme đặc hiệu được sử dụng với cơ chất đặc hiệu.

Cơ chất (subtrate):

là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm có màu xanh bước sóng 370-652nm chuyển màu vàng có bước sóng 450nm.

Chất dừng phản ứng (Stop solution):

là chất có khả năng dừng được quá trình kết hợp giữa enzyme và cơ chất và đổi màu dung dịch từ xanh sang vàng.

Với những lợi thế mà ELISA mang lại ứng dụng trong y học và trong kiểm nghiệm thực phẩm nên phương pháp ELISA đã được tiêu chuẩn hóa thành bộ KIT để sản xuất cũng như ứng dụng rộng rãi. Cho đến nay, kỹ thuật ELISA liên tục được cải tiến, tuy nhiên chỉ có 4 loại kỹ thuật chính là:

ELISA trực tiếp (Direct Elisa)

ELISA gián tiếp (Indirect Elisa)

ELISA sandwich (Sandwich Elisa)

ELISA cạnh tranh (Competitive Elisa)

Được coi là dạng ELISA đơn giản nhất. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể (plate) và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (đã được gắn enzyme). Phương pháp được ứng dụng trong phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm. Ví dụ xác định Staphylococcus Aureus

Phương pháp này khác Elisa trực tiếp ở chỗ kháng thể không gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng kháng thể khác (kháng kháng thể có gắn enzyme). Ứng dụng nhiều trong y học và trong hóa học thực phẩm.

Là một dạng Elisa phổ biến trong thực tiễn do có phản ứng nhanh và nhạy. Được gọi là “sanwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của 2 loại kháng thể là kháng thể bắt và kháng thể phát hiện.

Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ 3. Phản ứng cạnh tranh lành mạnh (đúng đắn) thì 2 chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời.

Hóa chất/kháng nào cần phân tích.

Kit thử có đáp ứng yêu cầu về giới hạn kỹ thuật của chất cần phân tích không (so sánh với giới hạn phát hiện).

Có hướng dẫn về xử lý mẫu đối với đối tượng cần phân tích không.

Độ nhạy, độ đặc hiệu đối với chất cần phân tích.

Độ thu hồi, độ lặp lại của kit thử.

Thời gian phân tích.

Quy trình có phức tạp không…

Tuy nhiên phương pháp ELISA chỉ là phương pháp sàng lọc và bán định lượng. Do vậy vẫn cần những phương pháp khẳng định để kết luận về sự hiện diện cũng như nồng độ của chất cần phân tích có trong mẫu.

Nhiệt độ bảo quản kit thử: trong quá trình vận chuyển và bảo quản tại PTN.

Thời hạn sử dụng gồm: thời hạn sử dụng của kit thử và thời gian từ lúc mở kit thử tới lúc kết thúc sử dụng kit thử đó.

Nhiệt độ ủ mẫu trong quá trình phản ứng

Thời gian ủ mẫu

Kinh nghiệm của kiểm nghiệm viên: chiết mẫu, lên giếng, đọc và đánh giá kết quả…