Tổng vi sinh vật hiếu được đếm bằng cách đổ và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30C/72±6 giờ
– Môi trường nuôi cấy: Platecount agar (PCA)
– Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau khi đã đồng nhất hoặt đã pha loãng ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng, mỗ nồng độ một đĩa. Trong 15 phút, đỗ vào mỗi đĩa 15-20ml môi trường nuôi cấy (PCA) đã được làm nguội đến 45C . Sau đó trộn điều mẫu và môi trường nuôi cấy
– Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ trong 72±6 giờ ở 30±1C
Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 44 ấn bản lần 4, 1995
Dựa vào sự lên lên men đường lactose ở môi trường thích hợp (thạch Violet red bile) ở 37C trong 24 giờ. Sau đó được khảng định lại trong môi trường canh Brilliant Green Bile Salt. Coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37C trong 24 giờ.
– Thạch Violet red bile (VRBL)
– Canh Brilliant Green Bile Salt (BGBL)
– Thạch Tryptone Soya (TSA)
– Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau khi đã pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng, sử dụng hai nồng độ pha loãng liên tiếp. Đổ vào môic đĩa khoản 5ml môi trường TSA ở 45C. Sau đó cho môi trường đông hoàn toàn đổ thên 10-15ml môi trường thạch VRBL 45C
– Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ trong 24±3 giờ ở 37±1C
Cấy riêng ít nhất 5 khuẩn lạcn nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa môi trường canh BGBL có ống Durham , ủ ở 37 0 C trong 24 giờ. Phản ứng được coi là dương tính khi có sự tạo khí dù chỉ một trong 5 ống nghiệm trên.
Phương pháp: tham chiếu theo TCVN 5287, ấn bản lần 2, 1994
Cấy một lượng dịch mẫu vào môi trường tăng sinh (canh Brilliant green bile lactose), lựa các khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc (EMB) để các phép thử sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC)
– Canh Brilliant green bile lactose BGBL.
– Thạch Eosin Methylene Blue Lactose (EMB)
– Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP)
– Canh Tryptone (hoặc peptone)
– Thuốc thử Methyl red 0,2%, α-naphtol 5%, kovac’s.
– Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tăng sinh (BGBL), ủ 44,0±0,5 0 C 24 giờ.
– Cấy phân lập: Sau khi tăng sinh cấy dịch mẫu từ ống nghiệm có phản ứng dương tính (môi trường chuyển đục và sinh hơi) sang môi trường EMB, ủ 37±1/24 giờ. Trên môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ điều, đường kính khoảng 0,5mm
– Chọn ích nhất 2 khuẩn lạc điển hìnhtreen môi trường chọn lọc sang môi trường thạch không chọn lọc (TSA) ủ ở 37±1 0 C trong 19-24 giờ.
– Kết quae thử nghiệm sinh hóa E. coli phù hợp: indol(+), methyl red(+), voges proskauer(-), khẳng sử dụng citrat(-)
– Phân lập: tu môi trường sinh cấy chuyển khuẩn dịch lên bề mặt môi trường phân lập XLD sao cho co thể tạo được những khuẩn lạc tách rời. Lật ngược đĩa ủ ở 37±0,2 4. Salmonella – Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 71 ấn bản lần 5. Năm 1999
4.1 Nguyên tắc – Phương pháp này chỉ dùng để định tính phát hiện hay không phát hiện – Quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua bốn gia đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh, phân lập và khẳng định.
– Canh Peptone đệm (BPW). 4.2 Môi trường và thiết bị – Canh Rappaport-Vasiliadis soy peptone. – Thạnh Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) – TSI, TSA – Canh Lysine decarboxylase, Urea phenol red, Manitol Phenol red báe
– Lấy mẫu: Lấy mãu ở vùng bề mặt càng rộng càng tốt – Tiền tăng sinh: trộn 25g mẫu với 225ml nước đệm peptone đệm, đônh nhất nhất băng máy dập mẫu. Ủ ở 37±0,1C từ 18 đến 24 giờ
1.3 Quy trình
Những khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra khảng định bằng thử nghiệm sinh hóa: Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urease (-), Indol (-), Mannitol (+), VP (-), LDC (+), ODC (+) và amygdaline (-)
0C trong 24±3 giờ. Trên môi trương XLD khuẩn lac Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường, phần lớn có tâm đen. Bao giờ cũng nhận thấy một vung môi trường đỏ lớn hay nhỏ. Phát hiện hay không phát hiện 4.4 Khẳng định 4.5 Đọc kết quả & báo cáo
Định lượng Clostridium bằng cánh cấy một lượng mẫu đã biết vào môi trường thích hợp có chứa ion Fe 5.1 Nguyên tắc 3+ và ion (S 2O 3) 2- ủ ở 37 0 C trong 1-2 ngày
5.2 Môi trường và thiết bị – Thạch iron sulphite – Dung dich muối peptone pha loãng
5.3 Quy trình – Cấy mẫu: Chuyển 1ml mẫu ở nồng độ thích hợp vào ống nghiệm. Sau đó, đổ 12ml môi trường thạch iron sulphite vào ống trộn điều mẫu trước khi môi trường đông lại. Sau khi môi trường đông đổ thêm 2-3ml môi trường thạch iron sulphite lên bề mặt ủ ở 37±1C trong 28-48 giờ
6. Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus – Phương pháp: tham chiếu theo sổ tay phân tích vi sinh FDA , ấn bản lần 8, năm 1995
– 6.1 Nguyên tắc Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. từ đây dịch khuẩn được cấy chuyền sang môi trường rắn chọn lọc. những khuẩn lạc giống Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.
– Thạch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar)
– Peptone kiềm chứa 1% Nacl (APW)
Tăng sinh:Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW. Dập mẫu 2 phút, ủ ở 37±1 Trên môi trường TCBS thạch khuẩn lạc 6.3 Quy trình 0C trong 6 giờ và 16-24 giờ Phân lập và đọc kết quả: từ môi trường tăng sinh cấy ria vào môi trường TCBS thạch ủ ở 37,0± 1,0C trong 18 – 24 giờ.V. cholerae tròn, lớn có đường kính 2-3mm hơi dẹt, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh. V. parahaemolyticus tròn, lớn có đường kính 3-4mm , màu xanh dương
-Khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 1,5% NaCl. ủ ở nhiệt độ 37,0± 1,0 6.4 Thử nghiệm sinh hóa oC trong 18 – 24 giờ.
+ Thử nghiệm sơ bộ:
Staphylococci aureus Coagulase positive Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 66 ấn bản lần 3, 1999
7.4 Đọc kết quả – Sau 24±3 giờ, trên môi trường Baird Paker khuẩn lạc Staphylococci aureus Coagulase positive có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng và lồi. Mỗi khuẩn lạc có quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình sẽ được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa. – Sau 48 giờ Staphylococci aureus Coagulase positive 1,5-2mm có màu đen, sáng và lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là một vùng sáng trong rộng 2-4mm . – Một vài chủng St. aureus không tạo quầng sáng trong bao quanh, vùng đục sát khuẩn lạc cũng có thê không có (khuẩn lạc không điển hình). Cả hai loại khuẩn lạc này điều được đánh dấu mặt sau của đĩa
Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và không điển hình sang môi trường TSA ủ ở 37±1 7.5 Khẳng định 0 C trong 24 giờ. Từ môi trường TSA cấy chuyển vi khuẩn sang các ống nghiệm có chứa 0,3ml huyết tương thỏ ủ ở 37±1C. kiểm tra sự hình thành khối đông sau 1,3,6 và 24 giờ. Kết quả Dương tinh có sự hình thành khối đông. Âm tính không có sự hình thành khối đông